Mol Cell︱李姗/傅暘课题组合作揭示病原菌催化新型翻译后修饰ADP-核糖脱氨环化的分子机制
病原细菌利用Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ Secretion System，T3SS）向宿主“注射”效应蛋白，操纵宿主细胞的信号转导通路，以帮助自身侵染和定殖，是许多革兰氏阴性病原细菌的核心感染策略[1]。紫色色杆菌是一种新兴的人类致病菌，具有多重耐药性，感染致死率高，然其致病机制尚不明晰[2, 3]。因此，通过解析紫色色杆菌T3SS效应蛋白功能揭示其致病机制是防治紫色色杆菌感染相关疾病的重要手段。华中农业大学李姗教授实验室研究发现紫色色杆菌T3SS效应蛋白CopC在辅因子钙调蛋白（Calmodulin，CaM）的帮助下可催化一种全新骨架的蛋白质翻译后修饰靶向宿主细胞多个半胱天冬酶（caspase），从而调控多种程序性细胞死亡信号通路，促进自身感染与繁殖。课题组将CopC催化的新型蛋白质翻译后修饰命名为ADP-核糖脱氨环化（ADPR-deacylization），并发现与CopC具有相同酶学活性的效应蛋白还存在于其它病原菌中，表明 CopC家族蛋白通过ADP-核糖脱氨环化修饰caspase蛋白来干扰宿主细胞死亡信号通路是病原菌普遍使用的一种致病策略[4]。然而，CopC催化ADP-核糖脱氨环化的酶学反应机制及辅因子CaM调控CopC活性的机制尚不清楚。
2022年11月23日，华中农业大学李姗教授课题组与南方科技大学傅暘研究员课题组合作，在Molecular Cell在线发表题为“Structural insights into caspase ADPR-deacylization catalyzed by a bacterial effector and host calmodulin”的论文。该研究综合运用生物质谱、结构生物学、生物化学、细胞生物学等多学科手段，揭示了病原细菌催化全新骨架的蛋白质翻译后修饰ADP-核糖脱氨环化（ADPR-deacylization）修饰caspase进而调控宿主程序性细胞死亡的分子基础，为开发相关细菌感染性疾病药物提供了新靶点和理论基础。
研究人员首先利用串联质谱鉴定到CopC对caspase-7/-8/-9进行多位点修饰，而对caspase-3只进行单一位点修饰，于是caspase-3被选为合适的底物蛋白进行后续结构研究。研究人员利用单颗粒冷冻电镜技术成功捕捉到CaM-CopC-caspase-3三元复合物与配体NAD+在反应前、反应中和反应后三种状态下的高分辨率结构。CopC由N端的催化结构域（N-terminal catalytic domain, NCD）以及C端的锚蛋白重复结构域（ankyrin repeats domain，ANK）构成，并通过其特有的”H-F-F-D”基序来结合和催化NAD+的水解。CopC的整体结构形似一只手，通过ANK形成的手指抓住底物caspase-3，同时caspase-3的活性区域（包含修饰位点R207所在loop区）贴在NCD形成的手掌上。辅助因子CaM则像一个扳指套在CopC的大拇指（N端螺旋）上,调节催化反应活性（图1左）。
图1 CopC催化ADP-核糖脱氨环化反应的结构基础
（图源：Zhang K et al., Molecular Cell，2022）
通过对不同状态下结构的比较分析，研究人员揭示了CopC催化ADP-核糖脱氨环化反应的分子基础。caspase-3 修饰位点R207上的NE（Nδ）原子比NH2（Nω）更接近烟酰胺核糖（N-ribose）的C1原子。NAD+的水解进一步缩短了N-ribose C1与R207 NE的距离，促进亲核取代反应的发生，使ADP-核糖基团转移至R207的NE原子上。随后N-ribose的2’-OH被活化，进攻精氨酸侧链胍基的碳原子，引发脱氨和环化反应，从而完成精氨酸的ADPR-deacylization修饰（图1右）。修饰反应完成后CopC NCD 上两个关键loop的构象发生变化，引起NCD与ANK相互作用面改变, 进而导致与ANK结合的caspase-3发生转动并远离NCD，最终造成caspase-3从CopC上分离。
图2 紫色色杆菌效应蛋白CopC调控机理
（图源：Zhang K et al., Molecular Cell，2022）
真核宿主中特异存在的钙调蛋白CaM是控制CopC活性的开关，那CaM是如何帮助CopC发挥功能的呢？研究人员比较了CopC-caspase-3二元复合物和CaM-CopC-caspase-3三元复合物的结构发现，在有CaM存在时，CopC的NCD催化结构域才可以正确折叠、有序组装。体外生化分析表明，Ca2+-free形式的CaM能够明显促进CopC催化活性，增进与底物caspase-3的结合能力，Ca2+-bound形式的CaM则使CopC处于无催化活性的状态，这一发现与宿主细胞静息状态处于低钙环境是一致的。研究人员在细胞中上调或下调钙调蛋白的表达量，对病原菌感染时CopC的活性有对应的调控作用。紫色色杆菌感染小鼠模型中也表明CopC与CaM的结合能力，对病原菌在小鼠肝脏的定殖以及对小鼠的感染致死能力至关重要（图2）。紫色色杆菌选择宿主特异性存在的蛋白作为自身毒力因子的辅因子保证了病原细菌毒力蛋白只在进入宿主后才发挥功能；且选择CaM来作为的辅因子是一个很聪明的选择，它巧妙地运用宿主细胞体内Ca2+浓度的变化来实现对毒力蛋白的活性调控。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.10.032
通讯作者：李姗（左），傅暘（右）
（照片提供自：李姗/傅暘课题组）
李姗，华中农业大学李姗教授多年来致力于病原微生物感染与宿主免疫分子机制的研究，发现多种“病原-宿主”互作分子机制。发现并命名两种全新蛋白质翻译后修饰（Arginine-GlcNAcylation和ADPR-Deacylization），对其中精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化修饰（Arginine-GlcNAcylation）完成了从“全新发现”到“分子机理解析”到“研究工具开发并商业化”的科学链条。详情请参考实验室主页（http://biomed.hzau.edu.cn/info/1023/1035.htm），如有兴趣申请李姗教授实验室博后，请发邮件至：lishan@mail.hzau.edu.cn。
傅暘，南方科技大学傅暘研究员课题组长期以生物大分子功能机制为核心从事病原-宿主-共生微生物互作研究。课题组在细菌VI型分泌系统领域深耕研究，近年来依托南科大冷冻电镜中心平台又在病原宿主蛋白多元互作、细菌孔道蛋白、病原宿主翻译后修饰等领域开辟新方向详情请参考实验室主页（https://www.sustech.edu.cn/zh/faculties/fu.html），如有兴趣申请傅暘研究员实验室博后，请发邮件至：fuy@sustech.edu.cn。
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本文完